細胞に発現するタンパク質の発現を、蛍光標識抗体を用いて検出する方法です。多種類のタンパク質発現を同時に検出することにより、主にリンパ球のフェノタイプ解析を行います。特にTリンパ球、Bリンパ球の分類に有用です。
委託先：東京大学附属動物医療センター 遺伝子検査部
検体
・末梢血液：EDTA処理血液 1-2 mL
・骨髄液：抗凝固処理サンプル（EDTA推奨）
・針吸引生検サンプル（リンパ節、脾臓など）：PBSまたは生理的食塩水に懸濁
・リンパ節/腫瘍組織：PBSまたは生理的食塩水に浸漬
＊凝固した検体、死細胞は解析できません
＊いずれのサンプルも凍結、固定不可です
＊生細胞数が不足していた場合には解析抗体数を減らす、あるいは解析できない場合があります
＊解析対象の把握のため、検体のスライド塗沫標本・血液検査結果の添付をお願いいたします
解析の原理
整列させた細胞が１つずつレーザーの前を通過し、各細胞についてのデータが収集されます。通常、一度の解析で概ね1万個以上の細胞を解析します。その特徴から、解析に用いる検体にはいくつかの条件があります。
1.細胞がばらばらに（シングルセルに）なっていること
✓ レーザーの前を１つずつ通過させることで解析が可能です
✓ 細胞をばらばらにするために酵素処理が必要な腫瘤は解析が困難ですが、リンパ節や脾臓など、物理的にシングルセル化させることができる場合には解析が可能です（お問い合わせください）
2.細胞が生存していること
✓ 死細胞には非特異的な抗体結合が起こり、偽陽性が生じます
✓ 凍結や固定した検体は解析できません
解析抗原
犬
- Tリンパ球マーカー（CD3, CD5, CD4, CD8）
- Bリンパ球マーカー（CD21）
- 単球/顆粒球マーカー（CD14, CD11b）
- 活性化リンパ球マーカー（CD25）
- 血液幹細胞マーカー（CD34）など
猫
- Tリンパ球マーカー（CD5, CD4, CD8）
- Bリンパ球マーカー（CD21）
- 単球/顆粒球マーカー（CD14, CD11b）
- 活性化リンパ球マーカー（CD25）など
＊症例によって解析抗原は異なる場合があります
解析例1. (犬T-CLL, 末梢血)
犬末梢血のFSC (Forward scatter, 前方散乱光) とSSC (Side scatter, 側方散乱光) プロット図。FSCは主に細胞の大きさを、SSCは主に細胞内部構造の複雑性が反映されるとされますが、正確な測定ではない点には注意が必要です。
リンパ球分画（青ドット）について表面抗原発現を解析すると、CD5陽性、CD21陰性のTリンパ球であることがわかります。
この症例はT細胞性慢性白血病と診断されました。なお、リンパ系細胞クローン性解析ではT細胞レセプター遺伝子のクローン性再構成が検出されています。
(右) リンパ球分画細胞のCD5, CD21発現パターン。
解析例2. (犬T領域リンパ腫, 末梢血)
犬末梢血のリンパ球分画についての表面抗原解析。CD3陽性、CD8陽性のTリンパ球であることがわかります。これらの細胞は汎白血球マーカーであるCD45の発現を失っていましたが、これはT領域リンパ腫においてよく認められる特徴として知られています。
この症例はT領域リンパ腫と診断されました。なお、リンパ系細胞クローン性解析ではT細胞レセプター遺伝子のクローン性再構成が検出されています。
(右) 同じく、CD45, CD18発現パターン。
解析例3. (犬多中心型リンパ腫, リンパ節FNA)
犬末梢血のFSCとSSCプロット図。大型リンパ球の増殖が認められます。
リンパ球分画について表面抗原発現を解析すると、CD5陰性、CD21陽性のBリンパ球であることがわかります。
この症例は多中心型リンパ腫と診断されました。なお、リンパ系細胞クローン性解析では免疫グロブリン重鎖遺伝子のクローン性再構成が検出されています。
(右) リンパ球分画のCD5, CD21発現パターン。
解析例4. (猫多中心型リンパ腫, リンパ節FNA)
猫リンパ節FNAサンプルのリンパ球分画についての表面抗原解析。CD5陽性、CD4陽性のTリンパ球とCD5陰性、CD21陽性のBリンパ球の両方の増殖が認められ、どちらのフェノタイプが腫瘍性増殖を示しているのか判断できません。
この症例のリンパ系細胞クローン性解析ではT細胞レセプター遺伝子のクローン性再構成が検出されており、Tリンパ球フェノタイプの腫瘍性増殖が示唆されます。
この症例は末梢血におけるリンパ球増加も認められており、末梢血で増殖するリンパ球のほとんどがCD5+CD4+のTリンパ球であることが示されています。これらの所見から、T細胞性リンパ腫と診断されました。
(右) 同じく、CD5, CD21発現パターン。
