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BRAF遺伝子変異解析の内容及び目的と意義

尿沈渣を用いた移行上皮癌・前立腺癌のデジタルPCRによるBRAF遺伝子変異解析検査

サンリツセルコバ検査センターでは、犬の移行上皮癌および前立腺癌における、尿沈渣もしくは前立腺マッサージ液沈渣を用いたBRAF遺伝子変異検査を受託しております。現在、本検査は当センターにて実施しております。

※現在の検査系には、これまで東京大学で使用されていたものと同一の系を用いております。

BRAF遺伝子変異は、ヒトでは悪性黒色腫や大腸がんなどで知られている遺伝子変異です。犬においても、膀胱移行上皮癌および前立腺癌で高率（60～80％）に認められることが報告されています。既報では、尿沈渣を用いたデジタルPCRによる高感度な遺伝子変異解析法が報告されており、尿中に存在するごく少数のBRAF遺伝子変異陽性腫瘍細胞の検出に有用とされています。

BRAF遺伝子変異とは

犬や猫における肥満細胞腫の発生にはc-KIT遺伝子の変異が深く関わっています。これらの変異は正常な細胞には認められず、遺伝子変異によりc-KIT分子が恒常的に活性化することでがん細胞の増殖を促進すると考えられています。
2015年に、同様の遺伝子の変異が犬の膀胱移行上皮癌と前立腺癌にも発見されました。それがBRAF遺伝子の変異です(図1)。
この遺伝子変異は尿路の移行上皮癌と前立腺癌の約70-80%で認められ、また悪性腫瘍以外の正常組織や炎症性疾患、移行上皮乳頭腫等の病態ではこの遺伝子変異は認められないことが確認されています(図2)。

 

 

尿沈渣・前立腺マッサージ液沈査を用いたBRAF遺伝子変異解析検査について

尿路移行上皮癌や前立腺癌では尿中や前立腺マッサージ液中に腫瘍細胞が剥離してきます。これを利用したものが本BRAF遺伝子変異解析検査です。これらの検体に含まれる細胞から遺伝子を抽出し検査を行うことで、BRAF遺伝子の変異の有無を確認します。もしも腫瘍を疑う症例であって、沈査中の細胞から抽出したBRAF遺伝子に変異が認められる場合は、移行上皮癌もしくは前立腺癌である可能性が極めて高いと考えられます。しかし、悪性腫瘍の中にもBRAF遺伝子に変異を持たない悪性腫瘍が20~30%存在しますので遺伝子変異が陰性であることは悪性腫瘍を否定する結果ではないことに注意が必要です。

このようにBRAF遺伝子変異解析検査は犬の尿路移行上皮癌及び前立腺癌の確定診断補助ツールとして有用ですが、単独で確定診断の根拠とすることはできません。診断に際しては、他の検査所見、特に細胞診（もしくはセルパック）検査所見と合わせて判断することが大切です。

Digital PCR法を用いた検査について

尿沈査・または前立腺マッサージ液沈査中から腫瘍の変異遺伝子を正しく検出するためには非常に高感度の検査法が必須です。なぜなら、尿路移行上皮癌や前立腺癌の症例では強い感染や炎症を伴っていることが少なからずあり、このような場合には数百個のBRAF変異を持たない炎症細胞に数個のBRAF変異腫瘍細胞が希釈されています。
既報研究では、複数の手法を比較検討した結果、デジタルPCR法が高感度に遺伝子変異を検出できることが示されています（図3）。通常のシークエンス法や制限酵素を用いた方法では偽陰性となり得る症例においても、デジタルPCR法は有用とされています。また、多数の分画を個別に解析することにより、検体由来のばらつきや検査工程上の異常を把握しやすい点も、本法の特長の一つです。

 

 

BRAF遺伝子変異検査検体採取・送付について

お問い合わせ

受付先およびお問い合わせ

㈱サンリツセルコバ検査センター 　中央ラボラトリー

〒135-0011 東京都江東区扇橋3丁目5番5号

TEL：03-6666-7631

FAX：03-6666-7632

E-mail：

 

 

依頼書ダウンロード

※ダウンロードボタンをクリックするとPDFファイルが表示されます。パソコン上で入力後、記入方法にしたがって印刷してご利用ください。

よくあるご質問

検体採取について

• サンプルはどのようなものがどのくらいあればよいですか？

   

  ▲尿沈渣、破砕性カテーテル法で採取した検体の遠心物などが利用できます。

  ▲いずれも細胞が数万個～あれば正確な検査が可能です。スピッツ管で作成した尿沈渣であれば1mm厚程度あれば十分ですが、検査依頼前に一部の検体を塗沫・鏡検し十分量の細胞が含まれていること（肉眼・低倍率でも細胞集塊の十分な広がりを確認できる程度）を確認しておくことを強くお勧めします。

   

• 検体の保存はどのようにすればよいですか？

   

  ▲液体検体（尿沈渣・前立腺マッサージ液）の場合は、遠心し上清を捨てて沈渣だけにして、冷凍保存/発送してください。腫瘍組 織の場合はそのまま冷凍保存/発送してください。

  ▲沈渣は密閉性の高いスクリューキャップチューブまたはエッペンチューブに入れて送付してください。スピッツ管はもれる ことがあるので、送付には使用しないでください。

   

• 尿全体を冷凍しても検査はできますか？

   

  ▲基本的にはお受けしておりません。尿中に核酸が漏出し、十分な濃度の検体が得られなくなる可能性があります。また、検体融解の際に容器が破損し、他症例の検体を汚染する可能性がありますのでご遠慮ください。

   

• 検体が不十分であった場合、途中で連絡をいただけますか？

   

  ▲原則として対応しておりません。デジタルPCR検査の性質上、検体量の十分性が最終段階で判明するためです。そのため、検査依頼前に検体中に十分な細胞が含まれているかをご確認いただくことが重要です。

   

• 猫の検査もできますか？

   

  ▲現在のところ、猫では本遺伝子変異に関する十分な報告がなく、本検査の対象外です。

   

• 細菌感染が あっても、検査できますか？

   

  ▲Digital PCRは非常に感度の高い方法です。ある程度の細菌の混入であれば問題なく検査を行うことできます。

  ▲菌数が著しく多いために細胞の含まれる率が下がってしまう場合や膿様になり細胞成分が変性してしまっている場合などに ついては正しい結果が得られない場合もあります。

   

検査結果について

• 陽性の場合

   

  ▲移行上皮癌または前立腺癌である可能性が極めて高いと考えられます。既報では、BRAF遺伝子変異陽性で良性疾患であった症例は報告されていませんが、最終判断にあたっては、他の臨床検査所見とあわせて総合的にご判断ください。

   

• 陰性の場合

   

  ▲陰性であっても、悪性腫瘍を否定することはできません。これは、BRAF遺伝子変異を持たない移行上皮癌や前立腺癌も一定数存在するためです。その他の臨床検査所見とあわせてご判断ください。

   

• 検査結果が検体不足でした。どのようにすればよいですか？

   

  ▲検体中に十分な細胞がいなかったということを意味しています。肉眼的な沈渣中に含まれていた成分が多量の結石であったケースなどが考えられます。これらは検査前に一部を塗沫・鏡検することで回避できます。また通常の採尿では細胞数が少なすぎる場合は、生理食塩水で膀胱内を複数回潅流する、破砕性カテーテル法を追加する等の方法で検体量を増やすことができます。

   

• 報告書に記載された「変異遺伝子の割合」にはどのような意味がありますか？

   

  ▲一般的に腫瘍細胞が多く含まれていると高く、強い感染等を伴い炎症細胞が重度に存在する場合には低くなります。0.15%以上であればどちらも陽性には変わりません。結果を同時に実施した細胞診と照らし合わせることで、検査結果間の比較をすることができます。

   

• 報告書に記載された「解析遺伝子数」にはどのような意味がありますか？

   

  ▲Digital PCR法の感度と特異度を十分に保つためには2,000-20,000の遺伝子が解析されることが望ましいと考えられます。ただしそれ以外の場合であっても、検体の内容次第（例えば検体中の細胞数は200個しかなかったが明らかに変異遺伝子が存在している）では、検査結果に結びつく場合もありますので、報告書の結果やコメントを参照してください。

   

• BRAF遺伝子変異腫瘍に対する分子標的薬はありますか？

   

  ▲現時点で、獣医領域においてBRAF遺伝子変異腫瘍に対して有効性が確立された薬剤の報告は限られています。ヒトではBRAF変異腫瘍に対する分子標的薬が複数ありますが、犬のBRAF変異腫瘍に対する有効性については十分な情報がありません。